摘要：目的基于厚朴“发汗”前后多指标质量差异关键属性优化厚朴“发汗”工艺。方法采用HPLC法同时测定“发汗”厚朴中紫丁香苷、木兰花碱、厚朴苷A、和厚朴酚及厚朴酚含量，采用CRITIC-层次分析法（CRITIC-AHP）复合加权法计算权重系数，多指标综合评分，结合Box-Behnken响应面法考察水煮时间、堆积天数、干燥温度及干燥时间对“发汗”厚朴质量的影响，优选厚朴“发汗”工艺。结果厚朴较佳发汗工艺为取厚朴药材，沸水水煮2min，堆积发汗1d，晾晒7d后于45℃烘箱内干燥36h。结论采用多指标含量测定、CRITIC-AHP复合加权法结合响应面法优厚朴“发汗”工艺，为厚朴产地加工“发汗”工艺考察提供参考。

厚朴为木兰科植物厚朴MagnoliaofficinalisRehd.etWils.或凹叶厚朴M.officinalisRehd.etWils.var.bilobaRehd.etWils.的干燥干皮、根皮及枝皮[1]，具有下气除满、燥湿消痰的功效，常用于治疗痰饮喘咳、食积气滞、脘痞吐泻及腹胀便秘等。厚朴的生理活性成分包括木脂素类、苷类、生物碱类及挥发油等[2-3]。现代药理研究表明，厚朴具有抗炎、抗菌、抗氧化及调节胃肠运动等作用[4-5]。

为了确保厚朴饮片的品质及疗效，传统认为厚朴干皮须进行“发汗”处理，以内表面变紫褐色或棕褐色为佳。“发汗”是保障厚朴道地性及药效的关键环节之一，厚朴经过“发汗”处理后，其外观、内在成分含量、药效均发生改变[6-7]，但部分产地厚朴存在未“发汗”处理或“发汗”工艺错乱不一的现象[7]，而《中国药典》年版所记载的厚朴“发汗”工艺（干皮置沸水中微煮后，堆积“发汗”后干燥）也没有可以客观量化的具体参数，不利于厚朴“发汗”质量控制。课题组前期研究发现，厚朴“发汗”后有效成分含量发生变化[5-8]，与药效有关的差异成分[9-12]主要为厚朴酚、和厚朴酚、木兰花碱、紫丁香苷及厚朴苷A。本实验以此5个质量差异关键标志物为指标，拟对厚朴“发汗”过程中的关键过程即水煮时间、堆积天数、干燥温度、干燥时间4项因素加以考察，并采用CRITIC-层次分析法（CRITIC-AHP）复合加权法计算厚朴饮片中紫丁香苷、木兰花碱、厚朴苷A、和厚朴酚及厚朴酚的相关权重，结合Box-Behnken设计-响应面法（BBD-RSM），优选厚朴“发汗”工艺，为规范厚朴“发汗”工艺提供参考。

1仪器与材料

1.1仪器

HTP-万分之一电子天平，上海花潮电器有限公司；CPAD十万分之一天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；-2AB电热鼓风干燥箱，成都中兴伟业仪器有限公司；UPK-I-优普系列超纯水器，四川优普超纯科技有限公司；Ultimate高效液相色谱仪，德国赛默飞公司。

1.2材料

对照品紫丁香苷（批号，质量分数＞98%）、木兰花碱（批号，质量分数＞98%）、和厚朴酚（批号，质量分数＞98%）、厚朴酚（批号，质量分数＞98%），成都益顺达有限公司；对照品厚朴苷A（批号DST-，质量分数≥96%），成都德思特生物技术有限公司。乙腈、甲醇均为色谱纯，成都科隆化学品有限公司；水为超纯水；其他制剂均为分析纯。

厚朴干皮收采于四川省绵阳市平武县（年7月1日），经成都中医药大学标本中心实验师连艳鉴定为木兰科木兰属植物厚朴M.officinalisRehd.etWils.的干燥干皮。

2方法与结果

2.1厚朴“发汗”工艺考察设计方法

《中国药典》年版记载的厚朴“发汗”工艺[1]为干皮置沸水中微煮后，堆置阴湿处，“发汗”至内表面变紫褐色或棕褐色时，蒸软，取出，卷成筒状，干燥。本实验在预实验的基础上，考察水煮时间（A）、堆积天数（B）、干燥温度（C）、干燥时间（D）4项因素。具体“发汗”工艺过程为将新鲜厚朴置沸水中微煮一定时间，阴凉通风处堆积一定时间，取出在阴凉通风处晾晒7d后，放入设定温度的烘箱中干燥一定时间。具体工艺参数见表1。

2.2厚朴“发汗”工艺考察指标

本实验基于对厚朴“发汗”前后有效成分的含量变化[4-5,7,9]、网络药理学预测[11]及药理活性[10,12-14]，筛选确定厚朴酚、和厚朴酚、紫丁香苷、厚朴苷A、木兰花碱5个成分为厚朴饮片“发汗”前后质量差异关键标志物，并作为本实验的“发汗”工艺考察指标。采用HPLC法测定5个成分的含量。

2.2.1HPLC含量测定方法的建立

（1）色谱条件：色谱柱为AcclaimC18柱（mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱0～5min，5%乙腈；5～20min，5%～20%乙腈；20～30min，20%～70%乙腈；30～35min，70%～80%乙腈；35～40min，80%乙腈；40～45min，80%～5%乙腈；体积流量0.8mL/min；柱温35℃；进样量10μL；检测波长为nm（紫丁香苷、木兰花碱）、nm（厚朴苷A、厚朴酚、和厚朴酚）。对照品、供试品HPLC色谱图见图1。

（2）对照品溶液的制备：精密称取对照品厚朴酚、和厚朴酚、紫丁香苷、厚朴苷A、木兰花碱适量，加70%甲醇配制成含厚朴酚0.mg/mL、和厚朴酚0.mg/mL、紫丁香苷0.mg/mL、厚朴苷A0.mg/mL、木兰花碱0.mg/mL的混合对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：精密称取厚朴粉末（过三号筛）0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20mL，称定质量，密封，超声辅助提取40min，放冷，称定质量，加70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液经0.22μm滤膜滤过，即得。

（4）线性关系考察：精密移取“2.2.1（2）”项下混合对照品溶液5mL，置于10mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，依次稀释对照品质量浓度，即得系列不同质量浓度的对照品溶液。精密吸取系列不同质量浓度对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以各对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，进行回归分析，得到各指标成分的回归方程、相关系数（r）及线性范围分别为厚朴酚Y＝.66X＋3.，14.～.μg/mL，r＝0.；和厚朴酚Y＝.13X＋1.，10.～.μg/mL，r＝0.；紫丁香苷Y＝.53X－0.，12.～.μg/mL，r＝0.；厚朴苷AY＝.36X－0.，23.～.μg/mL，r＝1.0；木兰花碱Y＝.35X＋0.，14.～.mg/mL，r＝1.0。

（5）精密度试验：取“2.2.1（2）”项下混合对照品溶液，按“2.2.1（1）”项下色谱条件进样检测，连续进样6次。计算厚朴酚、和厚朴酚、紫丁香苷、木兰花碱及厚朴苷A峰面积的RSD分别为0.17%、0.09%、1.82%、1.04%、1.24%，结果表明仪器精密度良好。

（6）重复性试验：取同一批供试品粉末（5号样品），平行6份。按“2.2.1（3）”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1（1）”项下色谱条件依次进样检测。计算厚朴酚、和厚朴酚、紫丁香苷、木兰花碱及厚朴苷A峰面积的RSD分别为0.09%、0.03%、1.%、0.78%、1.26%，表明本实验重复性良好。

（7）稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液（5号样品），按“2.2.1（1）”项下色谱条件在0、2、4、8、16、24h分别进样测定。计算厚朴酚、和厚朴酚、紫丁香苷、木兰花碱及厚朴苷A峰面积的RSD分别为0.10%、0.04%、1.76%、0.82%、1.23%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

（8）加样回收率试验：取已知各指标成分含量的厚朴供试品（5号样品）适量，共6份，每份0.25g，精密称定，分别加入等量的厚朴酚、和厚朴酚、紫丁香苷、木兰花碱及厚朴苷A对照品，按“2.2.1（3）”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1（1）”项下色谱条件测定，计算得到紫丁香苷、木兰花碱、厚朴苷A、和厚朴酚、厚朴酚的平均加样回收率分别为98.96%、99.28%、99.56%、98.88%、99.79%，RSD分别为0.53%、1.58%、0.87%、0.21%、0.29%。

2.2.2指标成分的含量测定精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。通过标准曲线回归方程计算各指标成分含量。

2.3“发汗”厚朴评价指标权重的建立

2.3.1CRITIC法计算权重CRITIC法是基于评价指标的对比强度和冲突性来综合衡量指标客观权重的计算方法[15-16]。将各成分测定的含量数据由公式［评价指标值＝(实测值－最小值)/(最大值－最小值)］进行处理，根据SPSSAU20.0软件处理数据得到相关系数矩阵，由综合权重（Cj）计算公式和客观权重（Wj），计算公式得到紫丁香苷、木兰花碱、厚朴苷A、和厚朴酚及厚朴酚5项指标的权重系数分别为0.、0.、0.、0.、0.。式中rij表示指标i（i＝1，2，3，n）和j之间的相关系数，δj为标准化后列向量的标准差。

2.3.2AHP法计算权重AHP层次分析法是一种需要人为判断各指标的优选顺序的主观权重计算方法[16-17]。根据厚朴“发汗”前后各指标成分的含量变化，将各指标成分含量作为权重指标予以量化，即5项指标3个层次，确定各指标的优先顺序为厚朴酚＝和厚朴酚＞紫丁香苷＝厚朴苷A＞木兰花碱，构建优先判断矩阵并确定各项指标的相对评分。根据评分结果，紫丁香苷、木兰花碱、厚朴苷A、和厚朴酚及厚朴酚5项指标的AHP权重系数分别为0.、0.、0.、0.、0.，一致性比例因子（CR）＝0.＜0.1，表明指标优先比较判断矩阵一致性较好，权重系数有效，结果见表2。

2.3.3CRITIC-AHP复合加权法计算权重通过CRITIC和AHP分别得到各项指标的相关权重，采用复合权重公式ω复合ij＝ωAHPωCRITIC/∑ωAHPωCRITIC计算[18]得到紫丁香苷、木兰花碱、厚朴苷A、和厚朴酚及厚朴酚5项指标的复合权重分别为0.、0.、0.、0.、0.。式中ωCRITIC表示CRITIC计算的权重系数，ωAHP表示AHP计算的权重系数。

2.3.4综合评分结果比较分别采用CRITIC法、AHP法及CRITIC-AHP复合加权法所得权重系数对试验结果进行评分，结果见表3。通过相关系数分析，CRITIC法与AHP法的相关系数为0.，CRITIC法与复合加权法的相关系数为0.，AHP法与复合加权法的相关系数为0.，其中CRITIC法与复合加权法的相关性显著（P＜0.05）。从权重系数分析，CRITIC法与AHP法的相关系数为0.，相关性不显著（P＞0.05），说明二者所反应的信息不具有叠加性。综合考虑采用CRITIC-AHP复合加权法。

2.4BBD-RSM优选厚朴饮片“发汗”工艺参数

2.4.1指标成分含量测定结果以水煮时间（A）、堆积天数（B）、干燥温度（C）、干燥时间（D）为自变量，厚朴“发汗”前后的5个质量差异关键标志物质量分数的综合评分为因变量，BBD试验设计及结果见表4。根据“2.3.3”项下得到的各指标权重系数，计算综合评分。

综合评分＝0.×紫丁香苷质量分数＋0.×木兰花碱质量分数＋0.×厚朴苷A质量分数＋0.×和厚朴酚质量分数＋0.×厚朴酚质量分数

2.4.2数据处理与分析采用Design-Expert8.0.6软件对表4中的数据进行分析，得到水煮时间、堆积天数、干燥温度、干燥时间与综合评分之间的二次多元回归模型方程：Y＝15.90－0.60A－1.87B－0.35C＋0.52D＋0.45AB－0.83AD＋0.95BC＋0.22BD＋3.71A2＋1.99B2＋0.72C2＋3.72D2－1.00B2C＋2.28BC2，P＝0.6，F＝7.56，表明模型差异有统计学意义；失拟项P＝0.，失拟项不显著，说明该模型拟合度和可信度均达标，实验误差较小，可以用此模型对厚朴“发汗”工艺进分析和预测。方差分析结果见表5。此回归方程也可以较好的反应出水煮时间、堆积天数、干燥温度、干燥时间与综合评分之间的关系，各因素对综合评分的影响顺序为堆积天数（B）＞水煮时间（A）＞干燥时间（D）＞干燥温度（C）。依据Design-Expert8.0.6软件得到二次回归方程模型及响应面图评价试验因素之间的交互强度，确定最佳炮制工艺参数，结果见图2。

根据模型拟合结果，预测厚朴饮片最优“发汗”工艺为最佳发汗工艺为水煮2min，堆积1d，晾晒7d后于45.46℃的烘箱中干燥35.97h，综合评分为30.。

2.5“发汗”工艺验证

取厚朴药材3份，按优选的“发汗”工艺进行发汗处理，考虑实际操作，将“发汗”工艺调整为水煮2min，堆积1d，晾晒7d后45℃干燥36h。按此工艺条件重复3次，实验结果见6。紫丁香苷平均质量分数为1.43mg/g，木兰花碱平均质量分数为4.58mg/g，厚朴苷A平均质量分数为13.15mg/g，和厚朴酚平均质量分数为25.08mg/g，厚朴酚平均质量分数为38.91mg/g，综合评分平均值为29.，与预测值（30.）的偏差为3.04%。

3讨论

3.1厚朴“发汗”前后多指标质量差异成分的确定

“发汗”作为确保厚朴的质量的关键一环，历版《中国药典》及民间传统生产都将其作为提升厚朴质量的方法。厚朴“发汗”后其外观和内在成分都发生显著变化[3]，本实验基于此现象进行“发汗”工艺优化。尽管采用不同的工艺参数进行“发汗”，厚朴在“发汗”后内表面都会逐渐变至紫黑发亮（图3），因此没有将厚朴“发汗”后的外观性状变化纳入本实验的考察指标。

为了使厚朴“发汗”工艺考察指标选择更为合理，本实验基于对有效成分变化[4-5,7,9]、网络药理学预测[11]及药理活性研究[10,12-14]等多个角度的厚朴“发汗”质量变化研究，最终确定厚朴酚、和厚朴酚、紫丁香苷、厚朴苷A、木兰花碱5个质量差异关键标志物作为“发汗”工艺考察指标。其中厚朴酚与和厚朴酚为木脂素类成分，是厚朴主要活性成分，发挥抗炎、抗菌、抗氧化、调节胃肠运动的作用[9,12]；紫丁香苷和厚朴苷A为苷类成分，具有抗炎镇痛，保护胃黏膜损失的作用[19-20]；木兰花碱作为厚朴中生物碱的代表成分之一，既是厚朴的潜在毒性成分，也是厚朴发挥抗溃疡作用的内在成分之一[9,11]。

3.2CRITIC-AHP复合加权法结合Box-Behnken响应面法优化厚朴“发汗”工艺

实验在前期预试验的基础上，考察了水煮时间、堆积天数、干燥温度、干燥时间对“发汗”厚朴质量的影响，并筛选相应因素水平。传统上厚朴“发汗”后是采用晒干的方法，然而晒干的方法药材水分含量差异大，容易回潮，不利于控制厚朴“发汗”质量，且现代干燥技术广泛运用于药材烘干及干燥过程[21-22]，效果与效率明显优于传统的自然晾晒，因此，本实验加入干燥温度及干燥时间2项因素[23]。权重系数的设定是厚朴“发汗”工艺优化中需重点考虑的问题，本实验采用主观-客观结合的方式，即采用CRITIC-AHP复合加权法，吸取2种类型赋权法的优点，使得到的数据信息更为全面可靠。实验采用复合加权法确定厚朴“发汗”工艺中各评价指标的权重系数，优选后的“发汗”工艺稳定可行，可为厚朴质量控制提供参考和数据支持。

3.3厚朴“发汗”过程中成分发生转变的途径

文献研究发现[6,8-9]，堆积时间越久，厚朴主成分厚朴酚、和厚朴酚的含量越高。但本实验结果发现，厚朴酚及和厚朴酚的含量增加与堆积天数并没有直接的联系，两者的增加是4项因素交叉作用的结果，且根据灰色关联度法分析结果，干燥时间及水煮时间对两者含量的影响更大，推测原因为厚朴“发汗”过程中许多苷类成分水解为糖苷及酚类化合物，长时间在一定温度下通过桂皮酸途径[9,24]转化为木脂素类（厚朴酚、和厚朴酚）。

另有文献研究表明[8-9,12]，厚朴苷A的含量在“发汗”后显著下降。而本实验发现，堆积天数对厚朴苷A含量的影响显著。在堆积1d的条件下，厚朴苷A的含量最高可达到翻倍，即从13.24mg/g增长至25.87mg/g，而当堆积4d时，厚朴苷A的含量与“发汗”前接近，堆积7d后，其含量明显下降，最低仅有4.59mg/g，推测原因为厚朴苷A是含有酯键、不饱和双键及多元酚羟基的不稳定结构，极其容易被水解和暂时性合成，在堆积发汗的前几天，厚朴中其他苷类成分水解得到的苯酚类化合物在相关酶的作用下暂时组合合成厚朴苷A，随着堆积时间的增加，这种不稳定结构也一并被水解反应[5,19,24]。本实验运用多指标质量差异关键标志物、现代分析技术及响应面法相结合的方式优厚朴“发汗”工艺，量化“发汗”工艺参数，以期为厚朴质量标准的建立提供数据支持。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源:刘畅，王潇，刘芳，刘绍瑒，胡慧玲，傅超美，邓彬．基于多指标质量差异关键属性优化厚朴产地加工“发汗”工艺[J].中草药,,52(3):-.药夫转载仅为传播行业信息，不做商业用途。若转载不当，请后台留言联系编辑，本平台将予以删除处理。感谢原作者的辛劳付出。文中插入广告与本